Tytuł projektu

Molekularne podstawy regulacji przepływu elektronów między błonową pulą ubichinolu, a pozabłonową pulą cytochromu c. Czy mitochondrialny kompleks III podlega przejściu między stanem „szybkim, a „wolnym”?”

Opis projektu

Celem projektu jest wytłumaczenie w jaki sposób na poziomie molekularnym cytochrom bc₁ (mitochondrialny kompleks III) bierze udział w regulacji działania łańcucha transportu elektronów i tworzeniu reaktywnych form tlenu (ROS). Regulacja jest istotna gdyż daje układom bioenergetycznym możliwość dostosowywania się do zmieniającego się zapotrzebowania energetycznego komórek i do warunków stresu (np. niedoboru tlenu).

Cytochrom bc₁ jest kluczowym punktem, w którym regulacja może zachodzić ze względu na to, że jako jedyny łączy dwa rezerwuary ruchomych przenośników elektronów łączących ze sobą poszczególne elementy łańcucha w funkcjonalną całość. Dodatkowo enzym ten, przez swój unikatowy cykl sprzęgający dwa przeciwstawnie działające miejsca katalityczne, może działać w oparciu o sprzężenie zwrotne ujemne.

By zidentyfikować elementy regulacji, w projekcie poddajemy szczegółowej analizie stany pośrednie reakcji zachodzących w miejscach katalitycznych i badamy ich wpływ na działanie enzymu. Naszym obiektem badań jest cytochrom bc₁ z bakterii purpurowej Rhodobacter capsulatus, w formie natywnej i odpowiednio zaprojektowanych i skonstruowanych mutein oraz mitochondrialny kompleks III. Porównanie bakteryjnego i mitochondrialnego enzymu ma na celu uzyskanie informacji na temat poziomu uniwersalności zidentyfikowanych elementów regulacji i sprawdzenia czy w układzie mitochondrialnym pojawiły się dodatkowe mechanizmy adaptacyjne do warunków, w których obecny jest tlen cząsteczkowy.

 

W badaniach spektroskopowych wykorzystujemy elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR) w trybie fali ciągłej bądź impulsowym w powiązaniu z technikami szybkiego zamrażania (freeze-quench) i zatrzymanego przepływu (stopped-flow). Wykorzystujemy też spektroskopię optyczną w pomiarach stacjonarnych i kinetycznych (opartych m.in. na możliwości indukowania światłem przepływu elektronu w błonach). Badania eksperymentalne uzupełnione są modelowaniem: symulacjami MD i QM do opisu elementów struktury i właściwości fizycznych oraz modelami stochastycznymi do opisu kinetyki procesów.

 

Zespół projektowy

Artur Osyczka - Kierownik Projektu

Marcin Sarewicz, Arkadiusz Borek, Agnieszka Broniec, Katarzyna Lorencik, Jakub Pagacz

 

W oparciu o badania prowadzone w projekcie dokonaliśmy szeregu ciekawych i istotnych obserwacji, w tym m.in: 

1. Wykazaliśmy możliwość tworzenia się spinowego stanu sprzężonego między semichinonem a klastrem żelazowo-siarkowym (stan SQ-FeS) w natywnych błonach bakterii fotosyntetyzujących w trakcie cyklicznego transferu elektron indukowanego światłem.
2. Zaobserwowaliśmy, że powstawanie stanu SQ-FeS zmniejsza prawdopodobieństwo powstania ROS, co może być jednym z mechanizmów zabezpieczających przed nadmiarem wolnych rodników w organiźmie.
3. Odkryliśmy istnienie dwóch form semichinonu w centrum redukującym chinon różniących się czasem relaksacji, co wynika z obecności utlenionego bądź zredukowanego hemu b. Zaobserwowaliśmy możliwość bezpośredniej wymiany elektronu między dwoma centrami w dimerze poprzez transfer z udziałem czterech hemów b.
4. Zaproponowaliśmy nowy model reakcji redukcji chinonu, w którym właściwa sekwencja transferu elektronów i protonów jest kontrolowana za pomocą zmian w polaryzacji ładunku i spinu semichinonowej formy przejściowej.
5. Wykazaliśmy, że stabilizacja wiązania wodorowego w rejonie reszt propionowych hemu podnosi potencjał oksydoredukcyjny (Em) hemu destabilizując jednocześnie jego niskospinowy stan w formie utlenionej. Na podstawie tych obserwacji zaproponowaliśmy zasadę, w myśl której wpływając na stabilizację wiązania wodorowego przy reszcie propionowej hemu możliwe jest modulowanie wartości Em, przy czym zakres zmian jest ograniczony koniecznością utrzymania właściwego stanu spinowego hemu. Przypuszczamy, że zasada ma charakter uniwersalny odnosząc się do innych białek hemowych a przez to może się też stać pomocna w projektowaniu sztucznych białek/aktywnych redoksowo układów zawierających hemy.

Publikacje

1. Sarewicz M., Osyczka A. (2021). Cytochrome bc₁ complex (respiratory chain complex III). In: Encyclopedia of Biological Chemistry III (Jez, J. Ed.) Eslevier INC. col. 2: 502-511
2. Kuleta P., Lasham J., Sarewicz M., Ekiert I., Sharma V., Ekiert R., Osyczka A (2021) Hydrogen bonding rearrangement by a mitochondrial disease mutation in cytochrome bc1 perturbs heme bH redox potential and spin state. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 118, e2026169118
3. Sarewicz M., Pintscher S., Bujnowicz Ł., Wolska M., Osyczka A. (2021). The High-Spin Heme bL Mutant Exposes Dominant Reaction Leading to the Formation of the Semiquinone Spin-Coupled to the [2Fe-2S]+ Cluster at the Qo Site of Rhodobacter capsulatus Cytochrome bc1[KS1] . Front. Chem. 9:658877
4. Sarewicz M., Pintscher S., Pietras R., Borek A., Bujnowicz Ł., Hanke G., Cramer W. A., Finazzi G., Osyczka A., (2021). Catalytic Reactions and Energy Conservation in the Cytochrome bc1 and b6f Complexes of Energy-Transducing Membranes, Chemical Reviews 121: 2020-2108
5. Pintscher, S., Wójcik-Augustyn, A., Sarewicz, M., Osyczka, A. (2020). Charge polarization imposed by the binding site facilitates enzymatic redox reactions of quinone. BBA-Bioenergetics 1861: 148216
6. Purhonen J, Grigorjev V, Ekiert R, Aho N, Rajendran J, Pietras R, Truvé K, Wikström M, Sharma V, Osyczka A, Fellman V, Kallijärvi J. (2020). A spontaneous mitonuclear epistasis converging on Rieske Fe-S protein exacerbates complex III deficiency in mice. Nature Communications  11: 322
7. Bujnowicz Ł., Borek A., Kuleta P., Osyczka A., (2018) Suppression of superoxide production by a spin-spin coupling between semiquinone and Rieske cluster. FEBS Lett. 593, 3-12
8. Borek A, Ekiert R., Osyczka A, (2018) Functional flexibility of electron flow between quinol oxidation Q_o site of cytochrome bc₁ and cytochrome c revealed by combinatory effects of mutations in cytochrome b, iron-sulfur protein and cytochrome c₁ Bioch. Biophys. Acta 1859, 754-761
9. Pintscher S, Pietras R, Sarewicz M, Osyczka A, (2018) Electron sweep across four b-hemes of cytochrome bc1 revealed by unusual paramagnetic properties of the Qi semiquinone intermediate Bioch. Biophys. Acta 1859, 459-469
10. Sarewicz, M. Bujnowicz, Ł., Osyczka, A. (2018) Generation of semiquinone-[2Fe-2S]⁺ spin-coupled center at the Qo site of cytochrome bc₁ in redox-poised, illuminated photosynthetic chromatopchores from Rhodobacter capsulatus Bioch. Biophys. Acta 1859, 145-153
11. Borek A, Ekiert R, Osyczka A, (2018) Advances in understanding mechanism and physiology of cytochromes bc. Book chapter in: Mechanisms of primary energy transduction in biology. Chemical biology no. 5. Edited by M. Wikström. Royal Society of Chemistry London pp. 192-214